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高通量|這才是藻類研究真正需要的一款工具!

時間:2022-07-05  點擊次數:778

ROTOR+最初是為芽殖酵母(釀酒酵母)遺傳學而設計。對萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)進行大規模的遺傳篩選,ROTOR+的功能可以發揮很大的作用。然而,衣藻與出芽酵母菌在細胞大小、生長速度、菌落形態和粘附性以及光響應性方面存在差異。因此,ROTOR+能否適用于衣藻類研究成為了關鍵。

因此在測試過程中要解決的下面的問題顯得尤為重要:

Q1:細胞是否通過ROTOR+可靠地從液體或固體介質中挑取到RePads復制針板上,在針頭之間、針板之間、不同平板間,細胞的數量/密度是否可以再生?

A1:可重復性挑取和接種的細胞數量,取決于細胞的表面特性:有多粘稠,粘附(或被排斥)在瓊脂表面的程度等等。衣藻在這些特性上不同于酵母。例如,在使用絲絨(酵母的標準方法)進行復制時,衣藻菌落有很強的傾向,要么*粘在平板上,要么*轉移到絲絨上。

Q2:細胞在此過程中是否保持高活力?

A2:轉移的細胞保持高活力顯然是必要的。從我們最初的工作中可以清楚地看出,在許多方面,衣藻在某些操作過程中比酵母菌或大腸桿菌更容易受到損傷。例如,當從瓊脂上挑取到玻璃或不銹鋼針上時,衣藻在空氣中大約40秒后就會幾乎*喪失生存能力。

Q3:針頭之間、源板之間或靶板之間是否有明顯的交叉污染?

A3:根據生物體的特性,可以很容易地想象,活細胞氣溶膠可以通過ROTOR+復制操作傳播,導致交叉污染和破壞實驗。

Q4:使用ROTOR+可以可靠接種和區分的菌落最大密度是多少?

A4:菌落可以被接種的最大密度取決于生物體的大小和生長速度,并將影響對生物體進行篩選的通量。

首先通過ROTOR+對液體到瓊脂的轉移展開相關實驗。

用Singer PlusPlates方板,注入50ml的TAP瓊脂(標準衣藻培養基),并添加了50μg/ml氨芐西林來抑制細菌污染。由于衣藻在液體介質中具有很強的流動性,對光線也有很強的敏感性,因此需要將ROTOR+上的內部光源取下,并在操作過程中盡可能遮擋光線。如果沒有這種預防措施,藻類會在源板的不同區域強烈聚集,會嚴重影響整個板的菌落再現性。

用一個注入25ml TAP的液體培養基平板,其中含有約10^6cells/ml濕的衣藻(cc-124背景),用384RePad長針,從液體到瓊脂,從384密度排列成1536密度,(針重復利用)。在33°C強光照下培養3天(圖1A),每隔一段時間顯微鏡觀察。

圖1:液體到瓊脂轉移

可以看到菌落具有明顯的活力,基本上每個細胞被接種18小時都形成了一個微菌落(圖1C)。平板的圖像顯示了接種區域的再生性,不同平板之間也觀察到良好的再生性。

另一方面,在這種固定密度下,菌落之間有明顯的空間分隔,中間沒有污染的菌落產生。

ROTOR+從挑取到接種需要5-10秒。為了測定在空氣中RePad上的衣藻活力,在挑取衣藻后和接種前分別暫停0、10、20和40秒,轉移的細胞數量及培養后的活力基本保持不變。從含有50ml細胞懸浮液的SINGER平板中,測試了液體到瓊脂的轉移,結果基本相同,表明了有效液滴大小與針插入的液體深度幾乎無關。

接下來通過ROTOR+從瓊脂到瓊脂的轉移展開實驗。

以含有TAP瓊脂的Singer PlusPlate方板為來源板,上有cc-124背景的衣藻菌膜。使用384RePad長針挑取細胞并轉移到新板上,連續點種16個點,過程中不回到來源板,這形成6144個點,每16個點逐漸稀釋接種物。用顯微鏡檢查這些培養皿,并培養成菌落。

從培養的菌落來看,菌落直徑約1毫米,連續接種導致轉移細胞的數量逐漸減少,該方法可用于將接種密度降低到孤立的單細胞。瓊脂-瓊脂接種的細胞存活率通常很高,幾乎相當于液體-瓊脂接種。

一般來說,單個細胞和由此產生的菌落和微菌落都停留在由針的幾何形狀決定的空間邊界內,因為衣藻在平板上是不活動的,而且幾乎不需要噴霧或氣溶膠就可以精確地進行操作。因此,這些程序適用于在有限的空間和耗材里,最大限度培養和轉移衣藻。

 

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